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芦丁联合奥沙利铂激活FKN/SYK/p38通路促进胃癌细胞凋亡

作者: 辽宁教育网 更新时间: 2021年01月13日 01:15:36 游览量: 156

简述:

芦丁(rutin, RT)异名芸香苷、路丁、维生素p、紫槲皮苷,是具有多种生物活性的黄酮类化合物,广泛存在于多种天然植物如槐米、苦荞麦、尤曼桉中,在医药、日化、食品等领域有广

芦丁(rutin, RT)异名芸香苷、路丁、维生素p、紫槲皮苷,是具有多种生物活性的黄酮类化合物,广泛存在于多种天然植物如槐米、苦荞麦、尤曼桉中,在医药、日化、食品等领域有广泛的应用。芦丁具有多种生理功能,对人体各个器官进行保护,如清除自由基、抗氧化、抗衰老、抑菌、抗炎、促进成骨细胞的生长、降低血糖等作用[-]。近年来其抗肿瘤方面作用成为研究的热点,具有价格低廉、几乎无毒副作用等优点[]。已有研究表明芦丁对结肠癌、肝癌等消化道肿瘤细胞有抑制增殖作用[]。本研究将芦丁联合奥沙利铂作用于人胃癌细胞SGC-7901,观察其对SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其增殖抑制作用是否通过FKN/SYK/p38通路,为胃癌的治疗提供更多的理论和实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株

人胃癌SGC-7901细胞株由吉林大学白求恩医学院生命科学院实验室馈赠,本实验室冻存储备。

1.1.2 药品与试剂

芦丁(南京景竹生物科技有限公司,纯度98%),注射用奥沙利铂(Oxaliplatin, OXA)(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号H20000337),p38抑制剂(SB203580;美国Sigma公司),高糖培养液(美国Hyclone公司),优级胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),噻唑蓝(MTT)(美国Sigma公司),二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司),Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国Sigma公司),鼠抗人FKN多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),兔抗人SYK、P38、p-P38、pro-caspase-3、cleaved-caspase3、7、8和9单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司),TRIzol(美国Invitrogen公司),吐温-20、SDS、过硫酸铵、丙烯酰胺、Tris-HCl、Glycine(北京鼎国昌盛公司),N, N’亚甲双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)(美国Sigma公司),总蛋白提取试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.1.3 仪器

倒置相差显微镜、生物显微镜(日本Nikon公司),DG5031型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司),电泳槽、流式细胞仪、CO2恒温培养箱、JJ260型精密电子天平(美国BD公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞体外培养

SGC-7901细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液,置于37℃、5%CO2饱和湿度的恒温密闭培养箱中进行常规培养并传代,0.25%胰蛋白酶消化,每2~3 d消化传代1次。

1.2.2 药物处理与分组

芦丁用DMSO配成1 mol/L的储液,-20℃保存,实验当日用无血清培养液稀释,其中DMSO的浓度均控制在0.1%以下;p38抑制剂及奥沙利铂均现配现用。实验设:(1)阴性对照组(药物浓度为0 μmol/L)、(2)p38抑制剂组(15 μmol/L)、(3)RT组(300 μmol/L)、(4)OXA组(33 μmol/L)、(5)联合组(RT 300 μmol/L+OXA 33 μmol/L)。作用24 h后观察细胞形态及密度的变化情况。利用中效原理计算给药浓度及联合给药剂量,抑制率(fa)=1-(实验组平均OD值/对照组平均OD值),根据中效方程式fa/fu=(D/Dm)m,计算出各药物单用及合用时各自的中效浓度Dm,作为以上药物浓度分组及联合给药剂量的依据,两药合用时在各种效应时的合用指数(CI)=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2,CI < 1为两药有协同作用。在药物作用12 h细胞凋亡并不明显,作用36、48 h细胞过度凋亡,几乎看不见存活的细胞,作用24 h观察细胞凋亡的状态最为理想,凋亡细胞形态清晰可见。

1.3 实验检测指标 1.3.1 MTT法测定细胞活力

取对数生长期的SGC-7901细胞,胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液制成浓度为5×104个/毫升的单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔200 μl,每组设6个复孔,37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温密闭培养箱中孵育至细胞单层铺满孔底时,将实验组中加入相应的药物。实验分组设阴性对照组、p38抑制剂组、RT组、OXA组、联合作用组。阴性对照组加入无血清培养液,p38抑制剂组的终浓度为15 μmol/L,RT组的终浓度为300 μmol/L,OXA组终浓度为33 μmol/L,联合作用组的RT和OXA的终浓度分别为300 μmol/L和33 μmol/L,培养至24 h,每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,继续培养4 h,终止培养,小心吸弃孔内上清液,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 min,使结晶物充分溶解。选择490 nm波长,以空白孔(无细胞,只含培养液)调零,酶标仪测定各孔光吸收值,实验重复3次,计算药物对细胞的存活率,细胞存活率=(实验组D490/对照组D490)×100%,结果取平均值。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞周期

文章链接:http://www.dqsjyg.cn/dx/41083.html

文章标题:芦丁联合奥沙利铂激活FKN/SYK/p38通路促进胃癌细胞凋亡